腫瘤免疫治療旨在激活宿主的抗腫瘤免疫，形成腫瘤抑制微環境，最終實現消除腫瘤，提高患者的整體生存率。腫瘤疫苗是一種很有前途的抗腫瘤免疫治療手段。針對腫瘤相關抗原（TAAs）或腫瘤特異性抗原（TSAs）的疫苗可以特異性攻擊和摧毀這些抗原高水平表達的惡性腫瘤細胞，并通過免疫記憶實現持續的腫瘤殺傷。因此，與其他類型的免疫治療相比，癌癥疫苗理論上可以提供特異、安全和耐受性良好的治療效果。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比傳統疫苗有許多優點：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會整合到基因組中，從而避免了對插入突變的擔憂；mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造，從而實現快速、經濟、高效的生產。此外，單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強針對適應性病原體的免疫反應，并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

mRNA疫苗是一類重要的癌癥疫苗，能夠編碼和表達TAA、TSA及其相關細胞因子。mRNA癌癥疫苗可以刺激體液免疫和細胞免疫，提高這些疫苗對不同疾病和患者的適應性。目前，多種mRNA癌癥疫苗正在臨床中進行開發，為癌癥免疫治療帶來新的曙光。

體外轉錄（IVT）mRNA模擬內源性mRNA的結構，有五個部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區（UTR），一個編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結構包含一個7-甲基鳥苷核苷，5′端結構會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協同工作，招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調節mRNA翻譯和半衰期。

編碼區兩側的5′和3′UTR調節mRNA翻譯、半衰期和亞細胞定位，來自高表達基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的選擇。此外，UTR可根據細胞類型進行優化，如通過去除3′UTR中的miRNA結合位點和富含AU的區域，將mRNA降解降至。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區那樣具有可塑性，但可以通過優化密碼子，從而在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發現人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗階段。

為了翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識別受體的識別，保證了翻譯過程產生足夠水平的蛋白質。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略，使用序列工程化和密碼子優化，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進外，在簡化mRNA生產方面也取得了重大進展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質粒在體外轉錄。另外，使用CleanCap的共轉錄封蓋技術，簡化了純化步驟。

由于mRNA較大（10⁴–10⁶Da）且帶負電，因此無法通過細胞膜的陰離子脂質雙層。此外，在體內，它會被先天免疫系統的細胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內應用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經為此開發了許多基于創新材料的解決方案。

脂質納米顆粒（LNP）

脂質納米顆粒是臨床上先進的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質，它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。

可電離脂質與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質帶正電荷并吸引RNA。此外，它們在內涵體的酸性環境中帶正電荷，這促進了它們與內涵體膜的融合，將其釋放到細胞質中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質。通過設計提高DODMA的功效，產生了DLin-MC3-DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。

目前，學術界和工業界的許多團體使用組合反應方案來合成潛在的傳遞材料，這種方法產生了許多有效的脂質，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

除了尋求提高療效外，人們越來越關注提高藥物的特異性，特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環金剛烷尾的脂質11-A-M58，和含有環咪唑頭的脂質93-O17S59，已被設計用于體內靶向T細胞。盡管機制尚不清楚，但這些脂質的環狀基團對于靶向T細胞至關重要。

盡管電離脂質可以說是LNP最重要的成分，但其他三種脂質成分（膽固醇、輔助脂質和聚乙二醇化脂質）也促進了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質，它通過填充脂質之間的空隙來增強納米顆粒的穩定性，并有助于在攝取到細胞的過程中與內涵體膜融合。

輔助脂質通過促進有助于膜與內涵體融合的脂質相變來調節納米顆粒的流動性并增強功效。最佳輔助脂質的選擇取決于可電離脂質材料和RNA載體。例如，對于類脂質材料，飽和輔助脂質（如DSPC）適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質（如DOPE）適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質（如DMPE或DMG）結合而成。親水性PEG可以穩定LNP，通過限制脂質融合調節納米顆粒大小，并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進展不如LNP，但聚合物具有與脂質相似的優勢，能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復合物，可通過內吞作用進入細胞。

聚乙烯亞胺是研究廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應用。此外，已經開發出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA傳遞方面表現出色，尤其是對肺。

最近開發出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉運體（CARTs），它能有效地靶向T細胞，操縱T細胞是非常困難的，因此，CART 是一種有吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領域具有巨大潛力。

其他遞送系統

除了脂質和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細胞中，這要歸功于其主鏈和側鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結合并形成納米復合物。例如，含有重復的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合細胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗。

最后，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細胞，誘導單核細胞分化為樹突狀細胞，并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質中的機制尚不清楚。

在注射mRNA癌癥疫苗后，mRNA編碼的蛋白質由核糖體合成，然后翻譯后修飾以產生正確折疊的功能蛋白質，并呈現給免疫系統。該過程類似于RNA病毒感染和連續誘導保護性免疫反應的自然過程。外源mRNA進入細胞質導致與內源性mRNA類似的反應。

誘導先天免疫反應

宿主免疫系統通過PRRs檢測病原體相關分子模式（PAMP）激活固有免疫反應。注射疫苗后，mRNA和傳遞系統成分將通過一系列PRR識別為外源性物質，導致Toll樣受體（TLR）的激活，例如主要在抗原呈遞細胞（APC）上表達的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被細胞膜、內體以及細胞質中的各種PRR識別，并在刺激內源性免疫反應中發揮作用。

IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介導。TLR7由B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表達，并介導識別單鏈RNA（ssRNA）的過程。在細胞質中，其他一些PRR可以感應不同類型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。

在非免疫細胞中，細胞質維甲酸誘導基因I樣受體（RLR）和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）感應外源mRNA并調節細胞因子和趨化因子的產生，導致天然免疫細胞募集到mRNA注射部位。

誘導適應性免疫反應

mRNA疫苗接種后，編碼的蛋白質將被翻譯并呈遞給免疫系統，并刺激適應性免疫。mRNA編碼的蛋白質通過內吞或吞噬作用被APC吸收，它們可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的內體，抗原蛋白通過樹突狀細胞上的主要組織相容性復合體呈遞。

mRNA癌癥疫苗通常編碼在癌細胞上表達的TAA。這些TAA可進一步分為組織分化抗原（如MART-1）、腫瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、腫瘤細胞過表達的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和腫瘤特異性突變抗原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）。此外，體細胞突變可能產生新抗原表位，碼新抗原的mRNA疫苗被認為是最佳的候選癌癥疫苗。

除了誘導T細胞免疫外，mRNA疫苗還誘導中和抗體。濾泡輔助性T細胞（Tfh）不僅對生發中心的發育至關重要，而且還驅動免疫球蛋白樣轉化、親和力成熟和持久的B細胞記憶反應。這些細胞可以被mRNA疫苗激活，產生足夠數量有效和持久的中和抗體。

基于IVT mRNA的疫苗正在逐步開發，用于多種腫瘤治療。目前，mRNA癌癥疫苗根據最終產品類型可以分為編碼TAA、TSA、細胞因子和抗體的癌癥疫苗。

編碼TAAs 的mRNA疫苗

在多項臨床試驗中，NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。

BNT111是一種BioNTech FixVac平臺開發癌癥疫苗，該平臺利用TAA的固定組合，旨在觸發針對癌癥的強大而精確的免疫反應。2021年底，FDA批準了BNT111快速通道資格，這是一種治療晚期黑色素瘤的新型癌癥免疫療法，目前BNT111正在兩項臨床試驗中進行研究。一項I期試驗（NCT02410733）的中期分析報告表明，BNT111是有效的免疫療法。隨后的II期試驗（NCT04526899）研究BNT111單獨或與抗PD-1抗體cemiplimab聯合的安全性和有效性。

CV9201和CV9202是兩種針對非小細胞肺癌中表達的靶抗原的mRNA疫苗。臨床試驗（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，這兩種疫苗耐受性良好，治療后可以檢測到免疫反應，從而支持在非小細胞肺癌中的進一步臨床研究。

編碼TSA的mRNA疫苗

編碼多種突變抗原的mRNA疫苗是治療突變誘發的惡性腫瘤的理想疫苗，這種類型的癌癥疫苗進行的臨床試驗最多。隨著下一代測序技術的發展，可以生產編碼突變抗原的個性化mRNA癌癥疫苗，這種個性化的癌癥疫苗具有非常誘人的前景。

兩種個性化mRNA癌癥疫苗目前正在進行二期臨床試驗，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在單個mRNA分子上特異性篩選和編碼20-34個新抗原，這取決于患者的癌癥突變。一期試驗（NCT03313778）的中期數據表明，mRNA-4157單藥治療或與PD-1抑制劑Keytruda聯合治療在所有測試劑量下都具有良好的耐受性，并引發新抗原特異性T細胞反應。該疫苗目前正在黑色素瘤患者進行二期臨床試驗（NCT03897881）。BioNTech 的BNT122已經探索了與PD-L1抗體聯合治療的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小細胞肺癌和大腸癌的II期臨床試驗已于2021上半年啟動。

mRNA編碼免疫刺激劑

理論上，mRNA癌癥疫苗可以編碼任何蛋白質，包括免疫刺激劑，其可以重塑腫瘤免疫微環境（TIME），克服腫瘤免疫耐受，這已成為mRNA腫瘤疫苗研究的一個重要方向。

在過去幾年中，已經進行了編碼細胞因子的mRNAs癌癥疫苗的臨床試驗。目前，臨床試驗中只有七種候選產品，它們屬于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna開發了第一個表達mRNA編碼的免疫刺激劑（mRNA-2416），其編碼OX40L，一項1期臨床試驗（NCT03323398）評估了mRNA-2416單獨和與durvalumab聯合的安全性和耐受性。已有的數據表明，mRNA-2416單藥在所有劑量水平下都是可耐受的，沒有報告劑量限性，大多數相關不良事件為1級或2級。更重要的是，在PD-L1上調的時間內觀察到廣泛的促炎活性和有益的變化。目前，mRNA-2416瘤內注射已進入晚期卵巢癌的臨床II期試驗。

另一種mRNA疫苗mRNA-2752編碼OX40L/IL23/IL36γ，早期的臨床結果表明，mRNA-2752與抗PD-L1抗體durvalumab聯合使用，在所有劑量下都具有良好的耐受性，并顯示出抗腫瘤活性的跡象。

此外，BioNTech還開發了編碼IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131，其作為單一療法或與cemiplimab聯合用于晚期實體瘤患者。

幾十年來，mRNA設計和核酸遞送技術的進步，加上新抗原靶點的發現，使得mRNA疫苗成為對抗癌癥的有力工具。mRNA疫苗的優勢體現在mRNA癌癥疫苗具有同時編碼多種抗原的能力，以及非整合、高度降解和無插入突變潛力。IVT產生的mRNA不含細胞和致病性病毒成分，沒有感染的可能性；在正在進行的臨床試驗中測試的大多數mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特異性免疫反應很少。

快速生產是mRNA癌癥疫苗的另一個優勢，并且mRNA制造技術的成熟允許在短時間內生產新型疫苗。最近新抗原的發現和鑒定促進了個性化疫苗治療的發展。BioNTech和Moderna進行的幾項臨床研究表明，在一些治療多發性實體瘤的臨床試驗中，使用個性化疫苗具有強大的抗腫瘤免疫，開創了治療性腫瘤疫苗的新時代。我們有理由認為，mRNA療法將可能改變現代醫學的疫苗接種方法以及癌癥免疫療法。